来源：生物世界

CRISPR技术自问世以来，就表现出无可比拟的优势，并深刻改变了基因编辑领域乃至整个生命科学的研究模式。CRISPR技术脱胎于天然存在于细菌/古菌中的CRISPR防御系统，例如CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas13，这些CRISPR系统可以识别并切割外来DNA或RNA序列，从而保护细菌免受噬菌体的侵袭。

有趣的是，最近发表于 Cell 期刊上的一项研究揭示了另一种相对不为人知的CRISPR系统——III型CRISPR系统（CRISPR-Cas10），其采用一种完全不同的方式发挥抗病毒免疫以保护细菌。

该研究由洛克菲勒大学 Luciano A. Marraffini 团队领衔完成，论文题为：The CRISPR-associated adenosine deaminase Cad1 converts ATP to ITP to provide antiviral immunity.

该研究发现，当细菌被噬菌体感染时，III型CRISPR系统被激活并引发一系列分子事件，最终释放三磷酸肌苷（ITP）这一细胞毒性物质。ITP通过三磷酸腺苷（ATP）的脱胺作用产生，它可以抑制细菌的生长，从而阻止噬菌体在细菌中的扩散。这相当于被感染的细菌牺牲了自己，使得整个种群得以存活。

III型CRISPR系统编码一个效应复合体，其中Cas10是识别靶标RNA以触发两种活动的主要亚基：单链DNA（ssDNA）降解和第二信使环寡聚腺苷酸（cOA）的合成。第一种活性是由Cas10的HD结构域催化的，当噬菌体RNA在裂解周期的早期表达时，就足以提供抗噬菌体免疫。相比之下，cOA的产生是由Cas10的Palm结构域催化的，以ATP为底物产生3'-5'cOA分子，主要形式为cA4或cA6。当噬菌体感染进入裂解周期晚期时，这一通路对于细菌群体的免疫防御是至关重要的。

在这种情况下，免疫是通过cOA第二信使激活CRISPR相关的Rossman折叠（CARF）效应物来实现的。除了与cOA配体结合的CARF结构域外，这些效应物还具有引起细胞毒性的第二个结构域，该结构域可引起细胞毒性，阻止噬菌体的裂解周期。

在这项最新研究中，研究团队表征了CRISPR相关的腺苷脱氨酶1（Cad1）的结构和功能，这是一个由CARF结构域与腺苷脱氨酶结构域融合的效应蛋白。他们发现，在cA4或cA6与其CARF结构域结合后，Cad1在体内和体外均可将ATP转化为ITP。

                                                          Cad1的激活会导致生长阻滞和高水平的细胞ITP

冷冻电镜（cryo-EM）对全长Cad1的结构研究显示，单个Cad1首先组成一个二聚体，然后三个二聚化的Cad1组装成一个六聚体复合物。Cad1具有两种活性位点，其中一个结构域间位点结合ATP，而另一个脱氨酶活性位点结合ATP/ITP。cOA的结合可以诱导脱氨酶活性位点的结构变化，将ATP转化为ITP。

                                                                           全长Cad1蛋白的三维结构

进一步研究显示，在噬菌体感染期间合成cOA后，Cad1激活并导致宿主细菌生长停滞，从而阻止噬菌体在细菌种群中的传播。打个形象的比喻，如果说最常见的CRISPR-Cas9的作用就像一把分子剪刀（molecular scissors），那么III型CRISPR系统的Cad1介导的细胞通路更像是分子熏蒸器（molecular fumigator）——释放有毒物质将宿主细菌和噬菌体一并杀死。

研究团队表示，Cad1介导的“毒性熏蒸”使得病毒被隔离在其中时，被感染的细菌牺牲了，但更大的细菌种群得以存活和延续。

                                                                      Cad1提供抗噬菌体免疫力

那么，为什么ITP对细菌有如此大的毒性呢？一种观点认为，过量的ITP会竞争蛋白质中通常由ATP或GTP占据的结合位点，这些结合位点对正常细胞功能至关重要；另一个观点认为，高水平的ITP会干扰DNA复制，从而同时抑制细菌和噬菌体。但这些观点都是推测，具体的分子机制还没有定论。

                                                                                            研究模式图

总的来说，这项发表于 Cell 的研究表明，III型CRISPR系统基于CRISPR相关腺苷脱氨酶1（Cad1）为宿主细菌提供了核酸降解以外的抵御噬菌体的适应性免疫机制。这一机制类似于哺乳动物先天免疫通路（例如cGAS-STING），通过产生环核苷酸以激活宿主的天然免疫反应。

此外，这项工作的一个潜在应用是作为病原体感染的诊断工具，一旦在反应体系中出现ITP，就表明样本中存在病原体转录物。这将促进基于RNA的体外诊断试剂盒的开发，类似于此前的DETECTR和SHERLOCK等分子诊断系统。